PD-1信号通路在原发性肝癌中的研究进展

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本帖最后由虎光着于 2018-8-2 17:57 编辑

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率为全球第5位，死亡率为癌症相关死亡的第三位。据国际癌症研究中心[11统计数据显示：肝癌在全球发病率逐年增长，已超过 62．6万／年，病死率近60万／年，具有病程发展快、恶性程度高、早期诊断率低、预后差的特点，严重危害人类生命健康口]。我国是肝癌大国，肝癌患者占全球的55％，肝癌防治更是任重道远。虽然数十年以来，在肝癌治疗方面取得了诸多进展，逐步形成了以手术、介入治疗为主的综合模式，极大地提高了肝癌的治疗效果，部份甚至可以达到临床治愈。但多数病人就诊时已发展至进展期或存在远处转移，已经失去手术机会而难以达到理想疗效，预后极差。近年来，随着对有创(手术)以及细胞毒(放、化疗)治疗的副作用、局限性认识不断深入，微创以及免疫治疗日益得到重视和更多的临床应用，以期通过更小的创伤或者调动、调节人体自身的免疫系统来达到以往常规治疗相近或者更好的效果。近来PD1／PD-L1为免疫监测点的免疫新疗法的突破性进展，也为肝癌治疗带来了新的曙光[3]。本文对Pnl／PnLl分子信号通路、原发性肝癌中的表达、PDl／ PD-L1抑制剂在原发性肝癌中的研究进展进行综述。

1、 PD-1／PD-L1与肿瘤免疫

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肿瘤是机体正常细胞恶变的产物，其特点是无限制地增殖并能够在体内转移。人体自身肿瘤免疫是机体对肿瘤的非特异性免疫和特异性免疫的总和。肿瘤免疫学上的关键就是验证在肿瘤细胞上特有的特异性抗原。特异性肿瘤抗原的存在，才使得机体免疫系统识别，并由此激发特异性免疫反应(包括细胞免疫和体液免疫)成为可能。此外，清除肿瘤细胞需要抗肿瘤特异性效应T细胞激活，肿瘤特异性CD8+T细胞是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。T细胞的完全活化需要“双重信号”：首先，T细胞表面受体(T cell antigen receptor，TCR)识别由抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)提呈的抗原肽一主要组织相容性复合体，使T细胞初步活化。进而，APC 表面的共刺激分子与T细胞表面的相应共刺激分子结合，使T 细胞完全活化成为效应T细胞。

肿瘤免疫治疗则是通过动员、调节机体本身的免疫系统，增强机体抗肿瘤免疫能力，从而达到杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的效果。肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最热门的研究方向之一。PD-1(programmed death-1)则是当前最受期待的一类免疫疗法。

正常情况下，机体完备的免疫机制能够有效地监视和清除癌细胞，因此，绝大多数个体不会出现肿瘤生长，已经发生肿瘤的患者也不容易发生肿瘤远处转移。生理状况下，正常组织细胞表面的PD-L1可以与淋巴细胞表面的PD-1结合，抑制淋巴细胞功能，诱导活化的淋巴细胞凋亡，从而防止自身免疫损伤保护正常组织器官。

病理状态下，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD- 1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PILL2，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，PD-L1与PD-1联接后，T 细胞功能被抑制，削弱或者阻断其向免疫系统发出攻击肿瘤的信号的能力[3。4]。使用PDl／PnLl抑制剂可以阻断PD-I与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。越来越多的证据[51]表明阻断PD-1与配体结合可以加强及维持内源性抗肿瘤效应，使肿瘤得到更加持久的控制。临床研究也发现：Pnl和PD-L1的抑制剂在已经在多种肿瘤(特别是晚期黑色素瘤以及非小细胞肺癌)中疗效显著并展现出良好的安全性。

2PD-1／PD-L1的分子结构及信号传导

PD-1于1992年由Ishida Y等正式提出，隶属于CD28免疫球蛋白超家族成员，最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤 2134．11克隆出来由于它和细胞凋亡密切相关，是一种重要的免疫抑制分子，故被命名为程序性死亡一1受体(P肛1)[8]。PD 1是一类分子量为55kD的工型跨膜糖蛋白，包含跨膜、胞质以及IgG V类似三个结构域。研究发现其中胞质尾区的免疫受体酪氨酸转换基序对于PD-1的免疫抑制功能十分重要。此外，PD-1还是一种诱导表达的蛋白，虽然检测到在NK、B、单核、树突以及CD4和8阳性T细胞上均有不同程度表达，但是主要还是表达在激活的B和T细胞表面。而在被激活之前，T 细胞几乎是没有PD-1的表达的，只有在接受抗原刺激之后，其表达才缓慢增加。

PDl的配体有两种，分别是PD-L1(B7一H1／CD273)和 PD-L2(B7一DC／CD274)，两者作用类似，主要功能都是与PD-1 结合后通过抑制T细胞受体介导B细胞增殖和白介素2、10、干扰素7等细胞因子的产生导致细胞周期停滞，从而抑制T细胞活化。因为这两种PD-1配体中又以PD-L1为主，故目前对于PD-1配体的相关研究主要集中在PD-L1上。

PD-L1同PD-1一样，也隶属于I型跨膜糖蛋白。PD-L1 是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和IgV样结构域，主要表达于成熟的CD4+ T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞，以及一些非造血细胞，如内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等的膜表面，值得重视的是多种肿瘤细胞均高表达 PD-L1分子。PD-1与PD-L1结合后可通过ITSM募集酪氨酸磷酸酶SHP一2，进而去磷酸化TCR信号通路上的多个关键分子抑制CD4 T、CD8 T细胞的增殖和活性，负性调节机体免疫应答过程。在机体正常免疫功能状态下，PD-1／PnLl信号通路的激活可最大程度减少免疫反应对周围组织的损伤，避免自身免疫不适当的扩大化[9“…，从而对正常机体组织起到保护作用。而对肿瘤患者，PDl／PnLl信号通路激活可使肿瘤局部微环境T细胞抗肿瘤免疫效应降低，表现出肿瘤呈免疫抵抗状态，导致肿瘤生长乃至转移[1“。在肿瘤患者中PD-L1与PD-1 的结合，可通过传递抑制性信号，抑制肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)活化、影响Th细胞分化、抑制效应细胞因子的产生、促进抑制性细胞因子的分泌、增加TIL细胞凋亡等方式抑制 TIL细胞的功能，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。研究发现：在肝癌和宫颈癌中，有近半数的肿瘤浸润CD8+T细胞表达 PD-1分子，其与肿瘤细胞表达的PD-L1结合后，将会导致 CTL细胞的耗尽及凋亡[12’“]。Shin等[15]发现用可溶性PD-1 融合蛋白(sPD-Ig)能够阻断PD-L1与PD-1的结合，增强CTL 细胞的功能，从而增强机体的抗肿瘤免疫，证实了PILLl与 PD-1的结合对TIL的抑制作用。此外，在肿瘤微环境中存在高水平的趋化因子9(CXCL9)和趋化因子10(CXCLl0)两种趋化因子，可促使CD8+T细胞进入肿瘤微环境，并诱导其表达 PD-1，肿瘤细胞通过其表面表达的PD-L1与CD8+T细胞表达的PD-1结合后，抑制CD8+T细胞产生细胞因子和颗粒酶 B[”。1“。同时，PD-L1还能抑制TIL产生干扰素(IFN)、白介素一2(IL-2)等炎性细胞因子，促进ILl0的表达，从而抑制TIL 对肿瘤细胞的杀伤[1“。以上研究证实PD-1／PD-L1信号通路确实地参与了肿瘤的免疫抵抗进程，P口1／PnLl型号通路是肿瘤免疫治疗极具价值的靶点，基于该靶点，肿瘤的免疫治疗有望取得更佳的疗效。

3 PD-1／PD-L1在肝癌中的表达

杨硕等[19]采用免疫组织化学法检测63例肝癌石蜡包埋组织标本中PD-1、PD-L1和NGF(神经生长因子)的表达量， 16例正常供体肝脏石蜡包埋组织标本作为正常对照组。比较不同病理分级、肝癌l临床分期、肝功能以及不同AFP水平情况下肝癌组织中PD-I、PD-L1和NGF的表达差异。结果显示肝癌组织中PD-1、PD-LI和NGF阳性表达率高于正常对照组升高。PD-1、PD-L1在肝癌组织中的表达在肝癌发生、发展及转移过程中可能发挥重要作用。并且，有意思的是：Ppl／PDL1阳性率在高、中和低分化肝癌组织中以中分化肝癌组织阳性率最为明显，机制尚待研究，提示中分化肝癌患者可能是抗 Pnl／PDLl治疗潜在的最佳适宜人群[2…。

Gao等口妇发现204例肝细胞癌(HCC)石蜡包埋样本中 PD-L1高表达，PD-L1阳性患者的术后复发风险是PD-L1阴性患者的2倍多。Wu等[”]报道了71例HCC中35例 (49％)有PD-L1高表达，而PD-L1高表达患者的生存率低于低表达患者。Geng、Wang等[2。24]在HCC样本中发现了PDL1高表达，与肿瘤分期呈正相关，而未发现与肿瘤分级有显著相关性。Chen等[25]在63例HCC样本肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中发现了29例(46％)有PD-L1高表达。

上述表明，肝癌细胞高表达PD-LI，PD-I／PD-LI信号通路激活能使肝癌细胞自身表面抗原修饰和周围微环境改变，肝癌组织中PD-I阳性的T淋巴细胞浸润也明显增强。PD-LI与PD-1结合，参与肝脏T淋巴细胞介导的免疫耐受，抑制肝脏组织中细胞毒性T淋巴细胞的功能，逃避机体免疫识别，诱导肝癌细胞的免疫逃避，从而导致肿瘤转移以及复发等，为P口1／ PD-LI抑制剂在肝癌中的应用奠定了理论基础。

4 PD-1／PD-L1阻滞剂在肝癌中的临床应用

我国是肝癌大国，肝癌的生存率很低，很多患者发现时已经是晚期。另外，晚期肝癌患者几近无药可用，目前FDA唯一批准的靶向药是索拉菲尼，但是客观缓解率不高，中位生存期为10～11个月[2“。近期靶向PD-1／PD-L1的免疫疗法在实体肿瘤(包括肺癌、大肠癌)或血液系统恶性肿瘤中，显示出令人振奋的抗癌作用。也为肝癌患者的治疗带来了新的希望。目前有5种处于临床试验阶段的抗体可作为阻断剂阻断PD-1／ PD-Ls信号通路，分别为MDX-1106／BMS-936558／ONO-4538 (全人IgG4抗PDl单抗，BMS)、CT-Oll(人源化IgGl抗PDl 单抗，CureTech／Teva)、MK一3475(全人IgG4抗PDl单抗， Merck)、BMS-936559(人源化PD-LI IgG4单抗，抑制PD-1和B7．1)和AMP224(B7一DC／IgGl融合蛋白，GSK)。但在肝癌相关的研究不多，目前研究结果尚少。

4．1 抗PD-1抗体Nivolumab(BMS-936558，MDX-1 106， ONO-4538)是全人源化免疫球蛋白G4、抗PINl抗体。2014 年美国FDA已批准Nivolumab用于治疗不可切除的或ipili— mumab治疗后进展的或BRAF V600突变阳性用BRAF抑制剂治疗后进展的黑色素瘤患者[2“。但研究发现Nivolumab的活性其实并不受BRAF突变状态的影响，而且野生型的BRAF 似乎获益更为显著(ORR 34．6％VS 29．7％)[2“。而和PD-L1 阴性患者相比PD-L1阳性患者的应答率更高，它们的中位PFS 分别为1．9和9．1个月。[293

紧接着2015年FDA又批准Nivolumab用于以铂类为基础化疗后进展的转移性鳞状非小细胞肺癌。今年ASCO公布了BMS的PD-I抗体Nivolumab的I／Ⅱ期I临床结果。临床试验表明nivolumab在进展期肝癌中安全有效[2“。研究中75％的患者接受过全身治疗，包括68％的患者接受过索拉非尼的既往治疗。在42例可评价患者中，8例(19％)在接受nivolum— ab治疗后获得缓解(肿瘤缩小30％以上)。其中4例取得了12 个月的持续缓解，1年的总生存率为62％。病情稳定者占 48％，最长的可达17个月。nivolumab安全性和耐受性良好，即使在HBV和HCV感染者中也非常安全。并开启了三期临床试验：Nivolumab一线对比索拉非尼用于晚期肝癌，计划招募726位患者，Nivolumab和索拉非尼比例为1：1。入组患者同时接受PD-L1表达情况的检测，用于以后的的数据分析。这次临床试验已于2015年11月启动，目前尚无结果，预计 2017年5月才会有一些初步数据获得披露，我们对该项研究结果充满期待。

Pembrolizumab(MK-3475)：pembrolizumab是一种人源化的抗PD-1的IgG4型单克隆抗体，也是第一个通过美国食品与药品监督管理局(FDA)优先审批程序的抗PD-I单克隆抗体。最早批准用于治疗晚期黑色素瘤[3…。Pembrolizumab属于当前备受瞩目的PD-1／PD-L1免疫疗法，该类药物旨在利用身体自身的免疫系统抵御癌症，通过阻断PDl／PnLl信号通路使癌细胞死亡，在临床试验中针对多种类型肿瘤均表现出强大的疗效。美国制药巨头默沙东与美国最大的癌症治疗中心一MD安德森癌症中心达成一项战略性临床研究合作，涵盖的肿瘤类型包括肝癌、胰腺癌、胃食管腺癌。目的是调查默沙东PD-1免疫抑制剂pembrolizumab联合其他药物(如化疗、放疗和／或新型抗肿瘤药物)治疗实体瘤的临床潜力。通过探索有前途的新替代疗法确定pembrolizumab的最佳组合，使其在治疗这些类型肿瘤发挥更好的抗肿瘤疗效。2015年AsC0会议上报告了一项重要研究[3“，并且同一时间在线发表于《新英格兰医学杂志》，足以证明该研究已被定位为免疫治疗的新里程碑。该项Ⅱ期研究确认了第1个基因标志物一错配修复 (MMR)缺陷，可以用来预测对抗PD-I抗体Pembrolizumab 的疗效，有效率(RR)在MMR缺陷组和完全组的结直肠癌患者中存在较大差异(62％VS．O)，疾病控制率的差异性更大，MMR缺陷组为92％，MMR完全组为16％。在其他MMR 缺陷患者中，RR为60％。基于该研究结果，更大型的随机试验已开始着手进行。由此可见，抗PD-1抗体Pembrolizumab 可能适合于肝癌的某一基因型，比如PD-1、PD-L1高表达的中分化肝癌，需更多的临床研究找到肝癌的最佳人群。

4．2抗PD-L1抗体BMS-936559为全长人IgG4抗体，其结合PD-1通路中的PD-L1。临床I期试验招募了286例癌症患者，试验结果显示，BMs-936559的活性可能不如BMS- 936558，其在不同癌症中诱导应答率为6％～17％[3钉。MP— DL3280A MPDL3280A是另一种抗PD-L1的单克隆抗体。在针对转移性尿路上皮癌的I期临床研究中，出现了43％患者肿瘤退缩的令人印象深刻的结果。它在治疗尿路上皮癌方面的作用被FDA认为突破性的进展。在其他实体瘤中研究甚少。其它的PD-L1的抗体还有MEDl4736(duravalumab)， AMp-224(NCT01352884)和MSB0010718c(avelumab)。虽然都尚处于I期l临床试验阶段，但已经显示出抗肿瘤活性[3“。

4．3抗PD-1／PD-L1的不良反应目前抗PD-1／PD-L1治疗主流的给药途径还是静脉全身给药，故就给药方式而言各种肿瘤抗PD-1／PD-L1治疗途径是没有差别的，因而不同肿瘤治疗中发生的各种不良反应理论上都可以相互借鉴。临床上使用的最多的还是黑色素瘤以及非小细胞肺癌，PD-1／PD-L1抗体总体安全性良好，药物相关不良事件总体发生率40％左右，3 级以上不良事件率6％～14％，药物相关死亡罕见，主要死因为药物相关性肺炎[34_35]。常见的不良反应在皮肤表现为瘙痒、红斑、斑疹、色素异常；胃肠道表现为腹泻、结肠炎、腹痛；内分泌表现为甲状腺、垂体及肾上腺功能的异常；肝脏可有转氨酶升高和肝炎；呼吸系统表现为肺炎和肺水肿。相较PDl抗体， PD-L1抗体耐受性更强，但均明显优于化疗。值得注意的是：汪国营等[361报道1例用PD-1单克隆抗体(pembrotizumab)治疗肝癌肝移植后复发而诱发急性免疫性肝炎患者，说明肝移植术后免疫抑制状态下不宜应用PD-1单克隆抗体等免疫检查点抑制剂，有诱发免疫性肝炎的风险。

4．4抗PD-1／PD-L1耐药虽然目前针对肝癌的抗PDl监测点治疗较少，关于其可能的耐药机制更是知之甚少，但是在其它肿瘤的抗PDl治疗研究中还是不可避免的发现治疗过程中的耐药现象。例如Zaretsky在2016年发表在新英格兰杂志上的文章就发现在对接受抗PDl治疗缓解后又复发进展的黑色素瘤患者肿瘤标本进行分析发现：分别出现B2M基因突变 (导致抗原呈递障碍)和JAKl 8L2基因突变及染色体杂合性缺失(导致肿瘤细胞对于干扰素杀伤作用去敏感化)，最终表现为对PDI抑制剂的耐药抵抗DT]。

Koyama等[38]人亦发现在小鼠肺癌模型中，抗PDI治疗耐药模型均存在多个免疫检查点分子表达上调，尤其是T细胞表面抑制分子TIM3表达上调最明显。同时再予抗TIM3处理又能提高对肿瘤的控制。说明TIM3也是抗PDl通路治疗重要的耐药机制之一。

以上的研究成果不仅对本研究肿瘤(黑色素瘤、肺癌)意义重大，也对抗PDl治疗肝癌耐药的处理策略提供了重要的思路。

5小结与展望

肿瘤免疫疗法是21世纪肿瘤治疗领域中最具前景也是最重要的成果之一，被《Science》评为2013年十大科学突破之首[39-40]。肝癌的免疫细胞治疗也已取得了多项令人振奋的结果。但PD-1／PD-L1通路信号转导机制及与其他致瘤途径相互作用等方面的研究仍处于早期阶段，PD-1／PD-L1信号通路的激活及肿瘤的微环境是相当复杂的，虽然多项试验已经证实抗PDl通路治疗的有效性以及近期的安全性，远期副反应(特别是远期慢性组织器官的免疫损伤)及自身免疫疾病影响尚不清楚，免疫治疗还任重道远。考虑到PDl监测点在人体的正常生理功能也十分重要，免疫增强治疗在临床中也不可能无限制的使用，未来的肝癌抗PDl治疗策略应主要从以下三方面展开

①局部应用：用介入的方式，影像介导下，精准地在肿瘤区域使用，有望能够突破免疫增强使用的限制，充分发挥PDl治疗的抗肿瘤效应，而不必担心其全身异常免疫亢进带来的毒副反应。

②联合应用：包括与肝叶切除、TACE、消融、放化疗或抗肿瘤基因以及靶向治疗的联合，不同免疫疗法的联合。因为与肝移植后免疫抑制相冲突，故肝移植患者理论上是不适宜与抗PDl治疗联用的。联合治疗肝癌应该是未来抗PDl治疗肝 · 1335· 癌主要的临床应用方式。

③肿瘤微环境状态的检测：免疫细胞浸润的数量，免疫细胞PDl表达以及肿瘤微环境PD-L1表达等都将不同程度影响抗Pnl／PDLl治疗疗效。通过对肿瘤微环境中具有疗效预测作用的生物标记物的检测可以筛选出适宜人群，避免盲目、扩大的免疫治疗，避免不必要的毒副反应，更有效率的应用抗PDl／PDLl治疗。从而实现免疫生物疗法的个体化精准定制。精准医学的概念与技术的发展，必将带动肝癌免疫生物治疗的个体化定制，即免疫检测点与免疫相关基因的检测与免疫生物治疗方案的定制与选择的对接。